Genome editing in bacteriën met CRISPR-Cas

1. Zoek op of er een PAM-site (NGG) is, deze heb je later nodig voor selectie
2. Voeg een homologe oligo toe die aan weerszijde van de PAM-site valt;   
- de oligo bevat een stopcodon (5' TAA) op de PAM-site
- de eerste 2 nt voor de 5' TAA zijn  ook anders dan de oorspronkelijke sequentie
3. Voeg de enzymen exo, beta en gam toe zodat homologe recombinatie kan plaats vinden

=> Nu heb je een mengsel van bacteriën waarin de recombinatie gelukt is en bacteriën waarbij het niet gelukt is

4. Voeg Cas9 en een CRISPR tegen de oorspronkelijke sequentie toe;
-nu wordt de onveranderde sequentie geknipt -> bacterie sterft
- de veranderde sequentie heeft geen PAM-site en een mismatch van 2 nt met de sgRNA -> die wordt dus niet geknipt, dus bacterie leeft